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他从羊头山带回黍种，在九峰山丹水河边买田试种，经过数年选种连种，终于培育出标准的黍粒。他把标准的黍粒横排100粒制成“横黍尺”，把黄钟律尺由九进制变成十进制，最终确定一律尺之长为25.48厘米，这为他发明“十二平均律”打开了计算通道。
第三次上羊头山是在他隐居九峰山以后，重新审定《律吕精义》等着作，准备编纂《乐律全书》期间。这次他进一步验证了所选的黍种，还详细考察了羊头山神农历史文化遗迹，准确完整地记录了唐代重修清华寺的碑文，使后人对始祖炎帝活动于羊头山的史实有了清晰明确的认识。
最终他写出了着名的考察散文《羊头山新记》，确认了庄里村炎帝陵的真实性，并指出羊头山因神农播五谷而成为天下名区。
这些经历展现了朱载堉坚韧不拔的意志和对学术研究的执着追求，他在艰苦的环境中取得了卓越的成就，为中国古代音乐、数学等领域的发展做出了重要贡献。
世宗死后，穆宗即位大赦天下，朱厚烷恢复爵位，朱载堉恢复世子身份，并回到郑王府。他与朱厚烷合作撰写《操缦古乐谱》《旋宫》等谱。着有《律历融通·序》《律学新说·序》。
万历十九年（1591 年），朱厚烷去世，五十六岁的朱载堉连续上疏，要求让出王位，经过十五年、七次上疏后获得批准。
朱载堉多次要求去掉皇位（放弃承袭王位）的原因主要是他对科学研究的热爱以及个人的志趣和追求。他志不在官场和富贵，而是醉心于学术研究。在父亲朱厚烷被软禁期间，他也经历了艰苦的生活，这使他更加看淡名利。此外，朱载堉可能认为放弃王位可以让他更自由地进行研究，不受宫廷事务和权力斗争的束缚。
朱厚烷去世后，朱载堉上疏放弃承袭王位，有司认为可让朱载堉的儿子朱翊锡承袭王位，但朱载堉仍不答应，十五年里七次上疏放弃袭爵，万历无奈只好答应，令载堉及翊锡以世子世孙禄终其身，子孙仍封东垣王。让爵之后，朱载堉自称道人。
他搬到怀庆府城外，继续写作。万历三十四年“进律书奏疏”，明神宗赐他建“让国高风”玉音坊。万历三十八年完成《律吕正论》；同年完成《嘉量算经》上卷，卷末记载自序。
万历三十九年（1611 年） 朱载堉逝世，终年七十六岁，明神宗赐谥号“端清”，次年三月廿六日，葬于九峰山。
朱载堉所处的时代，数学、天文历法等学科也取得了一定的进步，为他进行音律学的深入研究提供了有利的条件和方法。完成了十二平均律数理方法和全部理论的创建，在当时世界上居于领先地位。
他称十二平均律为“新法密律”，用勾股术、开平方术、开立方术等数学方法，计算出十二律每律的等比数，其数学表达史精确到小数点后 24 为有效数字，计算出的密率为 1.0。他还首创出有别于魏晋荀勖所创“同径管律”的“异径管律”管口校正法。
制造乐器和考证古乐器：制造了世界上第一架定音乐器弦准、十二平均律律管，考证了篪、钟、磬、瑟、笙等古乐器的诸多方面，为乐器史研究提供了参考材料。
提出“舞学”概念并创编舞谱：《乐律全书》保存了许多乐谱和舞谱，他首次提出“舞学”概念，将律学、乐学和舞学区分为三个独立的学科。其拟古舞谱极详尽地记下古代舞蹈的舞法、描绘了舞图和舞谱，还提出包括十大方面内容的舞学大纲，他的“天下太平”舞谱被视为今天团体操的先河。
天文历法方面：着有历学着作《律历融通》，编制《黄钟历》和《圣寿万年历》，求出计算回归年长度的公式，算出 1554 年的长度值与现代高科技测量结果仅差 17 秒钟；1581年差21秒钟，还是我国第一个精确计算出北京地理位置的人；
文学方面，其散曲集《醒世词》存小令73首，各领域着述多达百万字。是第一个精确计算出北京地理位置（北纬 39°56′，东经 116°20′）的人；
测出北京的地磁偏角为 4°48′，留下中国历史上第一个磁偏角的定量资料；发明用泥球涂以白粉悬于暗室，然后以灯光照射，演示“弦望晦朔之象”和日食的情景，总结出日食随观测地点不同有不同食分和“日大而月小”的科学结论。
数学和算术方面：是世界上最早解答已知等比数列的首项、末项和项数，及求解其它各项方法的人；最早变九进位为十进位，找到不同进位制的小数换算方法；最早运用珠算进行开平方、开立方、开高次方运算。着有《算学新说》《嘉量算经》《圆方勾股图解》等数学着作。
计量学方面：确定古人所说的尺长，测定水银密度，确定量制标准，从理论上辩证说明“同律度量衡”的关系，其撰写的《律吕精义》卷十中有计量学内容。
文学方面：以俚俗的韵语写成散曲《醒世词》存七十三首，今存世二十首，作品语言通俗、质朴，讽刺色彩浓郁。
朱载堉在数学、天文学、声学、乐律学、乐器制造和舞学等多个领域均有很高造诣，他的着作《乐律全书》，这是其所着 14 部着作的合集。
朱载堉的“新法密率”理论早于西方，关键数据被传教士带到欧洲后引起学术界震惊，影响了世界音乐文化史的进程，他也因此被人们誉为“科学和艺术的巨星”“东方文艺复兴史的人物”，并被联合国教科文组织公布为世界文化名人，从 18 世纪中期起，他的名字在西方被尊称为“王子载堉”。